NGS 분석의 기초 개념

Introduction to Next Generation Sequencing data analysis

아래 글을 참고하였습니다.

http://genestack-user-tutorials.readthedocs.io/guide/intro-to-ngs.html

NGS 기술은 차세대 시퀀싱 기술이라고 말하며, DNA의 시퀀스 정보를 빠르고 값 싸게 읽어내는 기술이다. NGS 기술이란 광범위한 의미인데, 예를 들어, WGS, RNA-Seq, WES, WGBS, ChIP-Seq 등을 NGS 기술이라고 말한다. WES(Whole Exon Sequencing) 데이터의 예를 들어서 NGS 데이터 분석하는 과정에 대해서 알아보자. WES이란 DNA 상의 Exon 부위의 염기서열을 읽어내는 기술을 말한다.

우선 큰 그림을 살펴보면, 일반적인 NGS 데이터 분석은 raw reads quality control, preprocessing, mapping, post-alignment processing, variant calling, annotation, and prioritization 으로 이루어져 있다.

이제 차례대로 WES 데이터를 처리할 때 어떤 스텝을 거쳐야 하는지 알아보자. 시퀀싱 데이터를 가지고 첫 번째로 해야할일은 바로 시퀀스의 quality를 체크하는 일이다. 이를 quality control(QC)이라고 한다. 일반적으로 read의 길이와 수를 체크하게 되고 contaminating 시퀀스나 낮은 quality의 시퀀스가 있는지 찾아야한다. 이후에는 preprocessing 과정을 거치는데 이는 시퀀스의 퀄리티를 증가시키기 위한 과정이다. QC와 preprocessing 과정은 매우 중요하며, 이 과정이 제대로 되어야지 이후의 분석 결과를 신뢰할 수 있게 된다.

다음 스텝은 mapping이다. 또는 aligning이라고도 불린다. reads를 reference genome이나 reference transcriptome에 정렬하는 것을 뜻한다.  (reference genome은 표준게놈 또는 참조게놈 또는 참조 서열 등으로 불리며, HG19, HG38 등을 예로 들 수 있다.) 이렇게 함으로써 데이터의 뉴클레오타이드 서열을 de novo assembly 없이 연구할 수 있게 된다. 예를 들어 WES 데이터의 경우 WES 데이터의 read를 reference genome에 mapping 한다면, reference와 WES 데이터의 시퀀스 간의 다른 부분(variant)을 알아낼 수 있게 되고, 이 variant의 정확도는 mapping accuracy에 의존적이다.

따라서 그 다음에 해야할 일은 바로 mapping quality를 체크하는 일이다. 데이터의 특정 종류의 bias는 mapping step 이후 나타난다. mapping quality가 만족스럽지 않으면 이를 processing하는 과정을 거쳐야하는데 이를 post-alignment processing 이라고 부른다. 예를 들어, 중복된 mapped read를 제거하는 것을 의미한다. (이는 PCR의 인공물이다.) 이는 매우 중요하며 앞으로의 분석에 큰 영향을 미친다.

시퀀스가 참조 서열에 align 되었다면, 데이터를 experiment-specific한 방법으로 분석을 해야할 필요가 있다. 우리는 여기서 WES 데이터를 참조 서열에 mapping한 후에, variant 분석을 할 것이다. 즉, variant calling과 그 variant가 gene에 미치는 영향 (단백질의 변화, frame shift 등)을 알아볼 것이다. 이 과정에서 시퀀스를 참조 서열과 비교하고, 차이를 확인하여 이 차이가 유전자에 얼마나 큰 영향을 미칠지에 대해 분석하여야한다. 예를 들어, 이것이 snynonymous variant(mRNA가 생성하는 아미노산에 변화가 없는 변이)인 경우에는 이 영향이 미미할 것이다. 하지만 그 variant가 사이즈가 큰 deletion 이라면, 해당 시퀀스를 포함하는 유전자에 큰 영향을 줄 것이라고 예측해볼 수 있다. 분석과는 별개로 데이터를 visualization 해볼 수도 있다. mapped read 데이터를 visualising 함에 있어 가장 표준적인 tool 중 하나는 Genome Browser이다.